目的 探讨Xpert MTB/RIF系统在结核分枝杆菌（MTB）及利福平耐药性快速检测中的应用。方法 收集2015年4–12月在安徽省胸科医院住院的616例肺结核和可疑患者痰液或肺泡灌洗液（BALF）样本,同时进行Xpert MTB/ RIF系统、液体培养法和直接涂片法3种方法检测,以临床诊断为金标准进行统计分析。结果 Xpert MTB/ RIF系统、液体培养法和直接涂片法检测MTB的敏感性分别为39.61%（225/568）、36.44%（207/568）和17.78%（101/568）,Xpert MTB/RIF系统检测的敏感性与液体培养法有较好的一致性（ χ2=1.21, P>0.05）,显著高于直接涂片法（ χ2=66.15, P<0.05）。在对利福平耐药性的检测中,Xpert MTB/RIF系统检出菌株对利福平的耐药率为19.40%（39/201）,Xpert MTB/RIF系统的敏感性和特异性分别为94.59%（35/37）和97.56%（160/164）,与液体培养法药物敏感性试验相比,差异无统计学意义（ χ2=0.167, P>0.05）。对所有培养阳性物进行利福平耐药基因分析,以测序法作为金标准进行 rpoB耐药基因检测,Xpert MTB/RIF系统检测利福平耐药位点以Probe E（58.98%,23/39）为主,测序法以S531L和L533P（62.16%,23/37）为主,2种方法突变位点基本一致（ χ2 =0.081, P>0.05）。结论 Xpert MTB/RIF系统检测MTB及利福平耐药性具有较高的临床应用价值。
中图分类号:R446.5 文献标志码:A 文章编号:1673-8640（2017）08-0722-05 DOI: 10.3969/j.issn.1673-8640.2017.08.014
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）感染引起的一种具有强烈传染性的慢性疾病, 以肺结核最为常见, 是导致人类死亡的主要疾病之一。根据2015年世界卫生组织（World Health Organization, WHO）报告, 2014年我国新发肺结核约93万例, 仅次于印度和印度尼西亚, 居全球第3位[1]。我国十三五结核病防治规划的目标是：在2030年使肺结核发病率降低80%, 病死率降低90%。要实现这个目标, 必须实行结核病的早期诊断及其耐药性检测。然而当前我国基层的结核病实验室基础设施薄弱, 结核病的确诊仍然依赖传统的涂片和培养方法, 检出率低, 培养周期长, 生物安全要求高。因此, 2010年WHO推荐Xpert MTB/ RIF系统用于结核病的快速诊断和利福平耐药性检测[2], 该技术在我国结核病防治机构被初步使用, 诊断性能方面的研究处于起步阶段。本研究采用Xpert MTB/RIF系统对肺结核及其可疑患者晨痰或肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）样本进行MTB及其对利福平耐药性的检测, 进而评价Xpert MTB/RIF系统在耐多药结核病快速诊断中的价值。
选取2015年4– 12月安徽省胸科医院连续收治的肺结核和可疑肺结核患者632例, 其中 Xpert MTB/RIF系统报错或利福平耐药结果不确定19例（3.0 %）, 重新留取样本均有结果。统计剔除液体培养污染16例, 用剩余616例有效数据进行统计分析。其中肺结核患者568例, 男381例, 女187例, 年龄（43± 9）岁。同期选取48例其他肺部疾病（肺癌19例、肺炎16例、支气管扩张13例）患者作为对照, 男32例, 女16例, 年龄（39± 6）岁。以细菌学检查阳性为确诊结核病的依据, 无细菌学阳性结果者则按《临床诊疗指南：结核病分册》[3]作出诊断。
分枝杆菌液体培养所用的BACTEC MGIT960系统、MGIT管和利福平药粉均由美国BD公司生产, Xpert MTB/RIF设备和试剂盒由美国Cepheid公司生产, 抗酸染液由贝索公司生产。
1.3.1 痰菌检测方法 留取所有研究对象1份晨痰或BALF样本, 按《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[4]进行N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH消化处理, 消化后的菌液重悬于1.1 mL的磷酸盐缓冲液中, 取0.1 mL按照实验室规范进行涂片抗酸染色检测, 0.5 mL用于Xpert MTB/RIF系统检测, 具体操作按参考文献[4]进行, 另外0.5 mL按照BACTEC MGIT 960系统用户手册接种于分枝杆菌培养瓶中进行液体培养法检测。
1.3.2 rpoB耐药基因核心区间测序 上游引物为5'-TCAAGGAGAAGCGCTACGA-3', 下游引物为5'-GGATGTTGATCAGGGTCTGC-3'。扩增条件：94 ° C 5 min, 94 ° C 1 min, 60 ° C 1 min, 72 ° C 1 min, 共35个循环, 引物的合成和产物测序在生工生物工程（上海）股份有限公司进行, 测序结果在NCBI网站采用局部相似性基本查询工具（basic local alignment search tool, BLAST）进行分析[5]。
1.3.3 结果判读 直接涂片法结果根据抗酸染色量的多少判为4+、3+、2+、1+和阴性; 液体培养法根据BACTEC MGIT 960系统报阳情况, 采用涂片萋尼染色镜检排除杂菌的污染后, 再进行液体药物敏感性试验, 并计算仪器的报阳时间; Xpert MTB/ RIF系统的结果以高、中、低、极低和未检出5个量级来表示, 循环次数（cycle time, CT）< 16, MTB检出高; CT为16~22, MTB检出中等; CT为 23~28, MTB检出低; CT为29~38, MTB检出极低; CT > 38, MTB未检出。5种分子探针（Probe A、B、C、D、E）表示利福平ropB基因的不同耐药位点。
采用SPSS 19.0软件进行统计学分析, 组间比较采用χ 2检验, 以P< 0.05为差异有统计学意义。
616例患者进行实验室诊断效能评价, 以临床诊断结果为金标准, 直接涂片法、液体培养法和Xpert MTB/RIF系统检测MTB的敏感性分别为17.78%（101/568）、36.44%（207/568）和39.61%（225/568）。Xpert MTB/RIF系统检测的敏感性与液体培养法有较好的一致性（χ 2=1.21, P> 0.05）, 显著高于直接涂片法（χ 2=66.15, P< 0.05）。见表1。
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在568例肺结核患者中, 直接涂片法阳性101例, 阴性467例。以液体培养法为金标准, 在直接涂片法阳性患者中Xpert MTB/RIF系统检测MIB的敏感性和特异性分别为96.77%（90/93）和62.50%（5/8）, Xpert MTB/RIF系统与液体培养法差异无统计学意义（χ 2=0.167, P> 0.05）, 在直接涂片法阴性患者中Xpert MTB/RIF系统检测MTB的敏感性和特异性分别为94.74%（108/114）和 93.20%（329/353）, Xpert MTB/RIF系统与液体培养法差异有统计学意义（χ 2=9.63, P< 0.05）; 在全部568例肺结核Xpert MTB/RIF系统检测MTB的患者中的敏感性为95.65%（198/207）, 特异性为92.52%（334/361）。见表2。
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Xpert MTB/RIF系统检测MTB结果分为高、中、低、极低和未检出5个量级, 其中在21例高量级样本中, 液体培养法均阳性, 培养报阳时间为17 d, 直接涂片法阳性19例中, 涂片阳性级别3+~4+者16例（76.19%）; 在69例极低量级样本中, 液体培养法阳性54例（78.26%）, 报阳时间为29 d, 仅有6例直接涂片法阳性（8.70%）; 在Xpert MTB/RIF系统未检出的343例样本中, 发现6例直接涂片法阳性, 其中液体培养法阳性5例, 报阳时间为40 d。见表3。
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对Xpert MTB/RIF系统、液体培养法均阳性的201例菌株同时进行药物敏感性试验, 结果显示Xpert MTB/RIF系统、液体培养法药物敏感性试验检出菌株对利福平的耐药率分别为19.40%（39/201）和18.41%（37/201）, 2种方法差异无统计学意义（χ 2=0.167, P> 0.05）。以液体培养法药物敏感性试验为金标准, Xpert MTB/RIF系统检测菌株对利福平耐药的敏感性和特异性分别为94.59%（35/37）和97.56%（160/164）, 见表4。Xpert MTB/RIF系统检测利福平耐药位点主要以探针Probe E（58.98%, 23/39）为主, 集中在位点529~533之间, rpoB测序法耐药类型以S531L和L533P（62.16%, 23/37）为主, 2种方法突变位点基本一致（χ 2 =0.081, P> 0.05）, 见表5。
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耐多药结核病给全球结核病控制带来了严峻的挑战, 早期快速的诊断是合理治疗的基础, 也是耐药结核病防治的关键。如果耐多药结核病不能得到及时、准确的诊疗, 最终会导致继发性耐药的产生和结核病死亡率的增加[6]。随着分子生物学技术的突飞猛进, 耐药结核病相关耐药基因快速诊断技术的使用日益广泛。Xpert MTB/RIF系统就是一种全新的快速诊断结核病和检测MTB耐药性的系统, 该系统针对MTB的81 bp利福平耐药核心区间（RRDR）设定引物、探针并进行扩增检测, 根据其是否发生基因突变来检测样本中是否含有MTB及其是否对利福平耐药, 可以全自动地对样本进行核酸提取、纯化及浓缩, 在2 h内出结果, 为全自动一体化半定量巢式实时聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）系统[7, 8]。
本研究采用抗酸染色直接涂片法、液体培养法和Xpert MTB/RIF系统对616例患者痰液或BALF样本进行检测, Xpert MTB/RIF系统检测的敏感性与液体培养法有很好的一致性（χ 2=1.21, P> 0.05）, 显著高于直接涂片法（χ 2=66.15, P< 0.05）。在101例直接涂片法阳性患者中, Xpert MTB/ RIF系统检出阳性93例, 敏感性和特异性分别为96.77%（90/93）和62.50%（5/8）, 与液体培养法比较, 差异无统计学意义（χ 2=0.167, P> 0.05）。在467例直接涂片法阴性患者中, Xpert MTB/ RIF系统检出阳性132例, 液体培养法阳性114例, Xpert MTB/ RIF系统与液体培养法差异有统计学意义（χ 2=9.63, P< 0.05）, 说明Xpert MTB/ RIF系统不仅在直接涂片法阳性病例中保持了很好的检测性能, 而且在直接涂片法阴性病例的临床使用中也有较好的敏感性和特异性, 这一点与国内外研究结果[9, 10, 11]基本一致, 只是不同研究中的敏感性和特异性稍有不同, 可能与研究中采用的“ 金标准” 不同有关。
Xpert MTB/RIF系统检测MTB分为高、中、低、极低和未检出5个量级, 其中在21例高量级样本中, 液体培养法均阳性, 培养报阳时间为17 d, 直接涂片法阳性19例, 涂片阳性级别3+~4+者16例（76.19%）; 在69例极低量级样本中, 液体培养法阳性54例（78.26%）, 报阳时间为29 d, 仅有6例直接涂片法阳性（8.70%）, 说明Xpert MTB/RIF系统半定量量级程度可能与样本中MTB菌数呈正比, 与阳性样本的MTB培养时间呈负相关, 量级数越高, 样本中含有的MTB菌数越多, 培养时报阳时间越短, 这与文献报道[12]相一致。在Xpert MTB/RIF系统未检出MTB的343例中, 共有6例直接涂片法阳性, 其中液体培养法阳性5例。3种方法不一致的原因可能是由于样本质量不好, MTB含量少或样本中含有Taq酶的抑制剂之故, 也有可能是样本前处理过量使Xpert MTB/RIF系统结果出现了假阴性, 从而造成该方法的漏诊。
在对利福平耐药性的检测中, Xpert MTB/RIF系统和液体培养法药物敏感性试验基本一致, 耐药率分别为19.40%（39/201）和18.41%（37/201）, 二者差异无统计学意义（χ 2 =0.167, P> 0.05）。对培养阳性物进行利福平相关耐药基因ropB测序对比分析, 发现Xpert MTB/ RIF系统检测的利福平耐药位点主要以探针Probe E（58.98%, 23/39）为主, ropB测序法耐药类型以S531L和L533P（62.16%, 23/37）为主, 二者具有较高的符合率, 这一点与FRIEDRICH等[13]研究相符。对液体培养法药物敏感性试验结果不一致的6例菌株阳性培养物进行ropB基因测序分析结果显示, 有4例符合液体培养法药物敏感性试验利福平敏感, 2例符合Xpert MTB/RIF系统利福平耐药, 可能原因是Xpert MTB/RIF系统直接检测痰液或BALF样本, 对样本本身质量要求较高, 如唾液口水等含菌量少或带有血液和食物残渣的样本都可能会直接影响其结果, 会造成利福平耐药结果的不确定性甚至直接导致测试失败（如本实验有19例Xpert MTB/RIF系统报错, 利福平耐药结果不确定, 被剔除）, 而液体培养法药物敏感性试验和ropB利福平耐药基因检测是通过阳性培养物进行的, 阳性培养物的菌量多, 结果也相对稳定。也可能是患者感染的是混合菌株, 经过培养后敏感株成为优势菌株, 使液体纯培养物测序为rpoB敏感, 而无法显示出现实存在的rpoB突变菌株。因此, 对于Xpert MTB/RIF系统阳性量级为极低, 且诊断为利福平耐药的患者需要使用传统药物敏感性试验或其他分子生物学方法进一步验证, 以避免假阳性的发生。但Xpert MTB/RIF系统检测MTB和利福平耐药性的时间能够缩短至2 h, 可以当天报告结果, 为结核病的早期诊断和治疗提供了可能, 可以缩短患者接受化疗的时间, 这一点具有良好的临床应用价值。
综上所述, Xpert MTB/RIF系统在快速检测MTB和利福平耐药性方面敏感性和特异性均较高, 且在一个完全封闭的检测盒中检测, 操作简便, 生物安全性好, 并具有高度全自动化。但Xpert MTB/RIF系统的设备和试剂盒成本较高, 短时期内在基层结核病防治和医疗机构推广尚存在一定的难度, 但随着医疗改革的深化和更多医保政策的优化, 该系统在临床的广泛应用会成为可能。
The authors have declared that no competing interests exist.
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